各省、自治區(qū)、直轄市食品藥品監(jiān)督管理局（藥品監(jiān)督管理局）：

　　為規(guī)范疫苗研發(fā)行為，指導(dǎo)疫苗研究單位科學(xué)地開展研究工作，根據(jù)《藥品管理法》、《藥品管理法實(shí)施條例》及《藥品注冊(cè)管理辦法》，我局組織制定了《預(yù)防用疫苗臨床前研究技術(shù)指導(dǎo)原則》、《生物制品生產(chǎn)工藝過程變更管理技術(shù)指導(dǎo)原則》、《聯(lián)合疫苗臨床前和臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》、《多肽疫苗生產(chǎn)及質(zhì)控技術(shù)指導(dǎo)原則》、《結(jié)合疫苗質(zhì)量控制和臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》和《預(yù)防用疫苗臨床試驗(yàn)不良反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)原則》等6個(gè)技術(shù)指導(dǎo)原則，現(xiàn)印發(fā)給你們，并請(qǐng)轉(zhuǎn)發(fā)轄區(qū)內(nèi)各有關(guān)單位。

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局
二○○五年十月十四日

預(yù)防用疫苗臨床前研究技術(shù)指導(dǎo)原則

前言

　　由病毒、細(xì)菌或其他病原微生物為起始材料，經(jīng)培養(yǎng)增殖制成的減毒、滅活的病原體，或再經(jīng)純化、裂解、亞單位（包括細(xì)菌類毒素）等方法處理制備的富含免疫原性，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫學(xué)反應(yīng)而達(dá)到預(yù)防某種疾病的產(chǎn)品，為預(yù)防用疫苗。

　　本指導(dǎo)原則適用于用病毒、細(xì)菌或其他病原微生物制備的預(yù)防用疫苗，其目的是為該類制劑提供一個(gè)共同的原則，指導(dǎo)制定臨床前研究的方案，和確定具體的研究?jī)?nèi)容。

一、基本原則

　?。ㄒ唬?yīng)符合國(guó)家《藥品管理法》等相關(guān)法律法規(guī)的要求；

　　（二）對(duì)所預(yù)防的疾病的流行情況進(jìn)行研究，包括疾病的危害程度 所涉及的人群及病原的型和亞型等；

　?。ㄈ?duì)研制該類制品用于預(yù)防疾病的有效性、安全性及必要性進(jìn)行分析；

　?。ㄋ模?yīng)對(duì)該制品用于預(yù)防該疾病的利益風(fēng)險(xiǎn)比進(jìn)行研究。根據(jù)該制品的預(yù)防方案可能達(dá)到的效果及可能出現(xiàn)的副作用或危害，對(duì)總體的利弊權(quán)衡進(jìn)行評(píng)價(jià)，并提出擬采取避免或減少其危害性或副作用的措施。這種評(píng)價(jià)將是該方案能否獲得批準(zhǔn)的重要依據(jù)之一。

二、用于疫苗研究用的菌毒種

　　研究疫苗所用的菌毒種必須證明為引起本病的細(xì)菌、病毒或其他病原體，如該菌毒株分離自人體，下述內(nèi)容必須清楚。

　?。ㄒ唬┚局昝Q及來源：

　　1．菌毒株名稱

　　2．菌毒株來源

　?。?）分離菌毒株的宿主一般情況；

　?。?）發(fā)病地點(diǎn)、發(fā)病日期；臨床確診日期、實(shí)驗(yàn)室確診日期；病人病程及病人轉(zhuǎn)歸。

　　3．菌毒株分離原樣本： 咽試子、漱口液、痰液、血液、糞便、尿液、尸解標(biāo)本的組織名稱；取樣日期；取樣時(shí)病人的病期。

　　4．鑒于人類的血液在同一時(shí)間內(nèi)較少感染多種病毒或細(xì)菌，而咽試子、漱口液、痰液、尿液、糞便等樣品難免污染其他外源因子，因此用病人血液分離的菌、毒株較適宜用于研究疫苗。

　　5．分離菌、毒株的其他自然樣本名稱、來源、數(shù)量、取樣方法等。

　?。ǘ┚?、毒株分離過程

　　1．用細(xì)胞分離病毒，所用細(xì)胞名稱、代次、來源應(yīng)清楚，應(yīng)進(jìn)行細(xì)胞無菌檢測(cè)、支原體和外原因子等檢測(cè)；病毒分離不宜使用腫瘤原性的細(xì)胞系。盡可能使用非腫瘤原性細(xì)胞，如人二倍體細(xì)胞或Vero細(xì)胞等。

　　2．用動(dòng)物分離病毒，對(duì)所用動(dòng)物名稱、品系、級(jí)別、年齡、接種途徑、飼養(yǎng)條件和制備毒種的動(dòng)物臟器名稱等須詳細(xì)記載；如再適應(yīng)到細(xì)胞，則還應(yīng)參照上述對(duì)分離用細(xì)胞的要求。

　　3．確定分離菌株所用培養(yǎng)基名稱、種類，以及分離培養(yǎng)的溫度和條件。

　?。ㄈ┚⒍局攴蛛x傳代特性

　　應(yīng)包括樣品處理方法、首次盲傳確證菌毒株陽性代次、菌毒株確證檢定方法、每代培養(yǎng)天數(shù)、病毒滴度、滴定方法、動(dòng)物是否發(fā)病或死亡等資料。

　?。ㄋ模┚痉N建立和保存

　　應(yīng)包括原始菌毒種代次、滴度，添加的保護(hù)劑的名稱和濃度、存儲(chǔ)條件等資料；原代菌毒種是指已適應(yīng)到可生產(chǎn)疫苗的細(xì)胞或培養(yǎng)基，可穩(wěn)定傳代、保留抗原性、并經(jīng)過檢定可用于疫苗生產(chǎn)的菌毒種。種子批的建立應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》“生物制品制品檢定用菌毒種管理規(guī)程”的要求，應(yīng)對(duì)種子批進(jìn)行菌毒種的傳代和限定代次的研究，以證明主種子和工作種子批在規(guī)定代次內(nèi)的生物學(xué)特性與原始菌毒種的一致性。

　?。ㄎ澹┚痉N的檢定

　　1．鑒別試驗(yàn)：可采用血清學(xué)、生物學(xué)、核酸序列分析等方法證明為該菌毒種。明確該病原體及其它相關(guān)生物分子的基因序列及結(jié)構(gòu)，并與我國(guó)主要流行株的核苷酸和氨基酸同源性進(jìn)行分析以及明確其血清型、亞型和/或基因型，對(duì)該種基因型或血清型的流行情況進(jìn)行分析，若存在不同的血清型或基因型，應(yīng)對(duì)所選擇的血清型或基因型與其它血清型或基因型交叉反應(yīng)或交叉保護(hù)性進(jìn)行分析和研究。

　　2．無菌檢查：按照現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》的要求進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。

　　3．外源因子檢查：按照現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》的相關(guān)要求進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定，取樣量應(yīng)足夠檢測(cè)試驗(yàn)的需要。

　　4．?dāng)U增能力和感染性滴度：應(yīng)能達(dá)到按生產(chǎn)工藝要求順利生產(chǎn)合格疫苗的要求。應(yīng)建立測(cè)定菌毒種擴(kuò)增能力和感染性滴度的方法和標(biāo)準(zhǔn)，并提供這些擴(kuò)增能力和感染性滴度與疫苗有效性之間的相關(guān)性數(shù)據(jù)。

　　5．免疫原性檢查：菌毒種的免疫原性是衡量該疫苗是否有效的重要指標(biāo)，應(yīng)制定和建立測(cè)定菌毒種免疫原性的有效方法和標(biāo)準(zhǔn)，以評(píng)估該候選菌毒種能否進(jìn)行疫苗生產(chǎn)。

　　6．減毒特性

　?。?）如研制減毒活疫苗應(yīng)對(duì)原始菌毒株的生物學(xué)、血清型、基因型和免疫原性進(jìn)行研究；減毒方法、減毒過程、減毒程度和減毒后的生物學(xué)、血清型、基因型和免疫原性，并進(jìn)行減毒前后的特性對(duì)比，尤其要對(duì)減毒后的安全性和免疫原性作出確切的結(jié)論；

　?。?）應(yīng)建立減毒特性指標(biāo)的驗(yàn)證方法、動(dòng)物模型和減毒后安全性的標(biāo)準(zhǔn)以及檢測(cè)和警戒毒力回復(fù)的依據(jù)等；

　?。?）對(duì)制備注射劑的減毒活疫苗，除一般的外源因子檢測(cè)外，還應(yīng)驗(yàn)證無逆轉(zhuǎn)錄病毒的污染。該驗(yàn)證方法可采用PERT法；

　?。?）如已知該病毒具有嗜神經(jīng)毒性，其驗(yàn)證要求可參考《IABS Scientific workshop on neurovirulence test for live virus vaccines， WHO，31 January 2005》。

三、疫苗的生產(chǎn)工藝研究

　?。ㄒ唬┙⒕痉N庫

　　應(yīng)建立三級(jí)種子庫。對(duì)種子庫的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行分析，明確該種子庫可以傳代的次數(shù)。生產(chǎn)用菌毒種、細(xì)胞和涉及生產(chǎn)的工藝技術(shù)應(yīng)注意專利，應(yīng)進(jìn)行相關(guān)專利查詢。

　?。ǘ┥a(chǎn)用細(xì)胞和/或培養(yǎng)基

　　1．生產(chǎn)用細(xì)胞應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》中“生物制品生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”的要求，如用傳代細(xì)胞系應(yīng)建立三級(jí)細(xì)胞庫；

　　2．生產(chǎn)用培養(yǎng)基盡可能避免使用動(dòng)物來源和可能引起人體不良反應(yīng)的原材料，禁止使用來自瘋牛病疫區(qū)的牛源性原材料。

　　（三）疫苗原液生產(chǎn)工藝的研究

　　1．生產(chǎn)工藝的主要技術(shù)參數(shù)的確定

　?。?）病毒與細(xì)胞的接種比例、MOI的最佳參數(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)和病毒培養(yǎng)的最佳溫度、培養(yǎng)時(shí)間和收獲時(shí)間。菌毒種的接種量，培養(yǎng)和發(fā)酵條件等技術(shù)參數(shù)的研究確定；

　　（2）滅活劑的選擇和依據(jù)；

　?。?）滅活或裂解條件及滅活或脫毒效果的驗(yàn)證，滅活效果驗(yàn)證的依據(jù)、方法；滅活效果的驗(yàn)證，應(yīng)采用盡可能敏感的細(xì)胞或培養(yǎng)基和方法進(jìn)行；

　　（4）原液的濃縮和/或活性抗原的提取純化等工藝研究：純化和提取工藝中各種條件進(jìn)行優(yōu)化，純化和提取工藝對(duì)抗原活性成分是否影響，應(yīng)建立穩(wěn)定的純化工藝，包括純化時(shí)的回收率、抗原活性和純度等的穩(wěn)定性；并制定相應(yīng)的質(zhì)控指標(biāo)和檢測(cè)方法，按GMP要求在符合GMP要求的生產(chǎn)環(huán)境下生產(chǎn)；

　?。?）初步確定起始投料、原液、半成品和成品的產(chǎn)出比的理論數(shù)據(jù)。

　　2．疫苗對(duì)佐劑的要求

　　目前能用于疫苗的佐劑多為氫氧化鋁，而鋁佐劑通常使疫苗產(chǎn)生的抗體滯后，且增加注射局部的副反應(yīng)機(jī)率。如疫苗的抗原能滿足免疫的需要，則不加佐劑為宜。如果在終制品中使用佐劑，則對(duì)以下問題應(yīng)進(jìn)行研究，對(duì)于已經(jīng)明確有佐劑效應(yīng)或者已經(jīng)商品化的佐劑，只需提供該類制劑的組分或化學(xué)組成，國(guó)內(nèi)外使用該類制劑的情況，無需再進(jìn)行毒理和安全性研究。若國(guó)內(nèi)外均未使用過該類佐劑，則必須對(duì)其作用原理、安全性及佐劑效應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)的研究并建立切實(shí)可行的評(píng)價(jià)方法。

　　（四）疫苗的配方研究

　　應(yīng)對(duì)疫苗的配方進(jìn)行研究，如疫苗中添加的穩(wěn)定劑成分，緩沖液、佐劑、以及凍干疫苗的賦形劑成分等是否對(duì)疫苗造成影響。

四、藥理、毒理和生物分布

　　疫苗不同于一般的化學(xué)藥品，藥理、毒理的實(shí)驗(yàn)要求具有特殊性，因此，該制品的藥理學(xué)試驗(yàn)主要包括發(fā)生作用的原理、生物效價(jià)與劑量的關(guān)系、免疫程序和接種途徑與效果的關(guān)系等；在毒理學(xué)方面主要考慮接種部位和全身的病理反應(yīng)、以及機(jī)體對(duì)該疫苗的非期望的免疫應(yīng)答反應(yīng)和這種反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間。由于以上各方面是互相關(guān)聯(lián)的，因此，應(yīng)綜合考慮藥理、毒理和免疫原性或生物效價(jià)的因素。

　　應(yīng)建立適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)及檢測(cè)方法來評(píng)價(jià)疫苗的免疫原性或生物效價(jià)，如果有動(dòng)物模型或可建立動(dòng)物模型的，可以采用動(dòng)物模型直接評(píng)價(jià)疫苗的生物效價(jià)，如：對(duì)一些有動(dòng)物模型的感染性疾病，可以采用病原體的攻擊實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)該疫苗的保護(hù)效果。而且要建立劑量與生物效價(jià)的關(guān)系，通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化免疫程序和接種途徑。若無法建立動(dòng)物模型，應(yīng)建立能驗(yàn)證該疫苗有效性的體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

　　滅活疫苗的生物分布較難檢測(cè)和評(píng)價(jià)。減毒活疫苗的生物分布應(yīng)建立敏感的動(dòng)物模型，可測(cè)定接種疫苗后的病毒血癥（或菌血癥）以及持續(xù)時(shí)間，排毒（菌）方式和途徑，對(duì)是否呈現(xiàn)體內(nèi)復(fù)制及感染的器官組織細(xì)胞應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)的研究。

五、質(zhì)量控制及檢定的要求

　　（一）生產(chǎn)過程中質(zhì)量監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)的建立及要求

　　在生產(chǎn)工藝的各個(gè)環(huán)節(jié)和步驟中的產(chǎn)品均應(yīng)建立相應(yīng)的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)，以便后續(xù)工藝的進(jìn)行，保證產(chǎn)品的質(zhì)量、工藝的穩(wěn)定性。

　　（二）產(chǎn)品的質(zhì)量檢定與要求

　　1．外觀檢查：根據(jù)樣品的特征建立外觀的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

　　2．pH值檢測(cè)：可根據(jù)一般生物制品的要求建立標(biāo)準(zhǔn)，一般為7.2±0.5.

　　3．純度：主要用于評(píng)價(jià)純化制品中含有有效成分的量和雜質(zhì)的最低限量，制定相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，通常可測(cè)定有效抗原在疫苗中的絕對(duì)值或測(cè)定主要雜質(zhì)的量推算有效抗原在疫苗中的相對(duì)值。

　　4．宿主細(xì)胞 DNA和蛋白殘留量檢測(cè)：采用傳代細(xì)胞生產(chǎn)疫苗，應(yīng)限制疫苗中的宿主細(xì)胞DNA和蛋白殘留量，進(jìn)行方法研究時(shí)應(yīng)建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，并對(duì)檢測(cè)試劑的敏感性和特異性進(jìn)行驗(yàn)證。疫苗中殘余宿主細(xì)胞DNA及蛋白殘留量可參考現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》的相關(guān)要求。

　　5.無菌檢查：應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》的相關(guān)要求。

　　6．熱原或細(xì)菌內(nèi)毒素檢查：可參照現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》的相關(guān)要求進(jìn)行； 也可以用其它方法檢測(cè)疫苗中的熱原物質(zhì)。

　　7．抗生素檢測(cè)：預(yù)防用疫苗在生產(chǎn)過程中不得添加青霉素或其他β內(nèi)酰氨類抗生素；如在生產(chǎn)過程中添加除上述以外的其他抗生素，應(yīng)建立相應(yīng)的檢測(cè)方法并規(guī)定抗生素殘留量的要求。

　　8．滅活效果的驗(yàn)證：由于制備疫苗的病原體一般均對(duì)人類致病，因此應(yīng)建立有效的滅活方法對(duì)該制品中的病原體進(jìn)行滅活，并應(yīng)對(duì)滅活效果進(jìn)行驗(yàn)證；在成品檢定中應(yīng)建立滅活劑殘留量檢測(cè)的方法和限度標(biāo)準(zhǔn)。

　　9．異常毒性檢查：應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》的相關(guān)要求。

　　10．穩(wěn)定性試驗(yàn)：是指疫苗在常規(guī)保存溫度下的穩(wěn)定性試驗(yàn)。由于穩(wěn)定性試驗(yàn)的結(jié)果直接與制品的效期有關(guān)，且試驗(yàn)觀察時(shí)間較長(zhǎng)，因此應(yīng)在生產(chǎn)工藝確定后盡早留樣進(jìn)行，定期取樣測(cè)定制品效力和其他相關(guān)的質(zhì)量指標(biāo)；對(duì)穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果與加速穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析對(duì)比，可為正式產(chǎn)品的有效期確定提供依據(jù)。

　　11．效力試驗(yàn)（生物效價(jià)）：由于用于預(yù)防的疫苗是通過機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)發(fā)生作用的，因此應(yīng)評(píng)價(jià)其體液免疫和細(xì)胞免疫的生物效價(jià)。在評(píng)價(jià)體液免疫效價(jià)時(shí)，應(yīng)選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的品系，建立檢測(cè)動(dòng)物血清抗體的診斷試劑，并對(duì)該類試劑進(jìn)行驗(yàn)證，可以計(jì)算小鼠ED50以及抗體產(chǎn)生的滴度，如有必要和可行，還應(yīng)當(dāng)建立評(píng)價(jià)抗體質(zhì)量的方法，對(duì)抗體的性質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，如亞型測(cè)定及抗原中和位點(diǎn)分析等；在評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫效價(jià)時(shí)，應(yīng)當(dāng)建立檢測(cè)評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫的方法（如特異性CTL反應(yīng)的方法或Elispot方法等），也可通過對(duì)細(xì)胞因子的定量檢測(cè)評(píng)價(jià)其細(xì)胞免疫情況，如屬于常規(guī)檢定項(xiàng)目，該類方法應(yīng)穩(wěn)定、重復(fù)性好、可操作性強(qiáng)，并制定相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。若有動(dòng)物模型，可進(jìn)行動(dòng)物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)。

　　12．佐劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)：如最終制品含有佐劑，則應(yīng)建立佐劑含量以及與之結(jié)合率的檢測(cè)方法，并制定相應(yīng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

　　13．疫苗標(biāo)準(zhǔn)品或參考品的研究：對(duì)于一種新疫苗而言，建立檢測(cè)疫苗的效力、免疫原性或毒性用標(biāo)準(zhǔn)品或參考品對(duì)判斷驗(yàn)室研究階段與批量投產(chǎn)后的疫苗質(zhì)量是否一致以及臨床試驗(yàn)的評(píng)價(jià)是非常重要的。

六、臨床研究用樣品要求

　?。ㄒ唬┥暾?qǐng)臨床試驗(yàn)用的疫苗，按照國(guó)家GMP的要求，在符合現(xiàn)行中國(guó)藥品GMP的生產(chǎn)條件下生產(chǎn)的。

　?。ǘ┡R床試驗(yàn)用疫苗樣品應(yīng)盡量使用與臨床前研究相同批的疫苗，其批量一般不少于1000人份，并能滿足臨床試驗(yàn)對(duì)疫苗量的要求。

　?。ㄈ┻M(jìn)行臨床試驗(yàn)的疫苗必須由中國(guó)藥品生物制品檢定所進(jìn)行質(zhì)量復(fù)核。

生物制品生產(chǎn)工藝過程變更管理技術(shù)指導(dǎo)原則

前言

　　本指導(dǎo)原則適用于已經(jīng)取得生產(chǎn)文號(hào)的生物制品生產(chǎn)過程等發(fā)生變更的管理技術(shù)指導(dǎo)原則，所指生物制品生產(chǎn)過程變更是指生產(chǎn)者對(duì)已獲國(guó)家藥品管理當(dāng)局批準(zhǔn)的生產(chǎn)全過程中的任何過程所進(jìn)行的任何變動(dòng)。包括從開始生產(chǎn)至終產(chǎn)品的全過程，及與生產(chǎn)相配套的輔助設(shè)施。其中包括原液制備，半成品配制及成品分裝等；變更后需重新申報(bào)按新藥管理的或重新申請(qǐng)生產(chǎn)文號(hào)的不包括在此范圍之內(nèi)。

　　本指導(dǎo)原則首先以國(guó)家頒布的相關(guān)法規(guī)及技術(shù)指導(dǎo)原則為基礎(chǔ)，并應(yīng)符合國(guó)家的相關(guān)要求，如國(guó)家現(xiàn)行GMP規(guī)范要求。

一、原則

　?。ㄒ唬┤魏紊a(chǎn)過程的改動(dòng)都是以提高產(chǎn)品的安全性和有效性為基本出發(fā)點(diǎn)，在提高或至少不改變最初國(guó)家批準(zhǔn)產(chǎn)品安全性和有效性的基礎(chǔ)上進(jìn)行相關(guān)改進(jìn)。

　　（二）擬進(jìn)行生產(chǎn)過程變更的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)向SFDA提出申請(qǐng)，并遞交相關(guān)方案和資料，提供證明資料，說明該變更不引起產(chǎn)品質(zhì)量的內(nèi)在變化，由SFDA組織專家進(jìn)行審查并確定變更的類型及應(yīng)遞交的相關(guān)材料。

二、概述

　?。ㄒ唬┥a(chǎn)過程變更：根據(jù)其對(duì)終產(chǎn)品質(zhì)量的影響，一般分為以下3種情況。

　　1、變更引起產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量發(fā)生改變的，需要按新藥申報(bào)程序進(jìn)行申報(bào)為I類，請(qǐng)參考《藥品注冊(cè)管理辦法》附件4藥品補(bǔ)充申請(qǐng)注冊(cè)事項(xiàng)及申報(bào)資料要求；

　　2、變更可能對(duì)產(chǎn)品的安全和有效性有影響的為II 類，需報(bào)SFDA審批；

　　3、一般不影響產(chǎn)品安全性和有效性的為III 類，需報(bào)SFDA備案。詳見下表。

生產(chǎn)變更分類表

───────────────────────────────
　　　　　　　　　生產(chǎn)變更內(nèi)容　　　　　　　　　　　　　類　型
───────────────────────────────
一、主要原輔材料
　　原料或起始原材料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　I
　　培養(yǎng)基或其主要成份　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　關(guān)鍵原輔料的來源　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　牛血清及胰酶等　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
二、菌毒種庫及細(xì)胞庫
　　原始種子庫　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　I
　　主代種子庫　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　工作種子庫　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　III
三、生產(chǎn)工藝
　　減少或增加工藝步驟　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　病毒滅活方法變更　　　　　　　　　　　　　　　　　　　I
　　培養(yǎng)時(shí)間變更　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　分離、純化方法變更　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　參數(shù)變更　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　緩沖液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　III
　　生產(chǎn)規(guī)模改變　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
四、配制
　　防腐劑　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　佐劑（新佐劑除外）　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　賦型劑　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　穩(wěn)定劑　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　稀釋劑（新稀釋劑除外）　　　　　　　　　　　　　　　　III
五、成品
　　檢定方法　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　I
　　質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　I
六、主要生產(chǎn)設(shè)備（如消毒、凍干、分裝、發(fā)酵罐血液制品生產(chǎn)　I
　　用離心機(jī)、壓濾機(jī)）
　　一般生產(chǎn)設(shè)備　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
───────────────────────────────

　?。ǘ┥a(chǎn)過程變更均應(yīng)進(jìn)行相關(guān)的技術(shù)評(píng)價(jià)，并應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。

　　1．原材料或起始原材料

　　2．培養(yǎng)基主要成份

　　3．菌毒種、細(xì)胞株主代種子庫

　　4．生產(chǎn)工藝部分變更，如增加、減少分離步驟或由精制改為柱層析

　　5．病毒滅活方法變更

　　6．培養(yǎng)時(shí)間改變

　　7．分離、純化方法的變更

　　8．緩沖液、參數(shù)改變；

　　9．生產(chǎn)規(guī)模改變（單批10倍以上規(guī)模）

　　10．主要生產(chǎn)設(shè)備的變更（如消毒、凍干、分裝、發(fā)酵罐、血液制品生產(chǎn)用離心機(jī)、壓濾機(jī)）

　　11．防腐劑、佐劑、輔料；

聯(lián)合疫苗臨床前和臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則

前言

　　聯(lián)合疫苗是指含有二個(gè)或多個(gè)活的、滅活的生物體或者提純的抗原，由生產(chǎn)者聯(lián)合配制而成，用于預(yù)防多種疾病或由同一生物體的不同種或不同血清型引起的疾病。如果將載體疫苗和偶聯(lián)疫苗的載體菌或偶聯(lián)的載體成分所引起的疾病也作為其適應(yīng)癥時(shí)，則載體疫苗和偶聯(lián)疫苗也屬于聯(lián)合疫苗。

　　在本指導(dǎo)原則中根據(jù)聯(lián)合疫苗的研究經(jīng)驗(yàn)和結(jié)果，提出了有關(guān)臨床前研究和臨床研究中應(yīng)注意的問題和要求。論及的內(nèi)容不可能面面俱到，在實(shí)際應(yīng)用中可能會(huì)遇到許多技術(shù)問題，對(duì)于特定問題和特定的制品，應(yīng)視具體問題具體研究決定。本指導(dǎo)原則亦將隨科學(xué)技術(shù)發(fā)展和經(jīng)驗(yàn)積累而逐步完善。

一、聯(lián)合疫苗研究開發(fā)中應(yīng)考慮的問題

　　聯(lián)合疫苗的研發(fā)過程中，應(yīng)對(duì)聯(lián)合后疫苗各組分間的相互作用，以及防腐劑、佐劑和非活性成分等對(duì)聯(lián)合后活性成分的影響等進(jìn)行研究。應(yīng)證明聯(lián)合后的疫苗在安全性和有效性方面至少與單價(jià)疫苗是相等的。

　?。ㄒ唬┙M分間的相容性

　　以往的經(jīng)驗(yàn)表明，單價(jià)疫苗在聯(lián)合后會(huì)使疫苗的安全和效力發(fā)生改變。有時(shí)聯(lián)合疫苗中的某種成分會(huì)對(duì)其他的一種或多種活性組分起到抑制或增強(qiáng)的作用，例如：當(dāng)全細(xì)胞百日咳疫苗與滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗（IPV）聯(lián)合后會(huì)使百日咳的效力下降；另外，當(dāng)用活疫苗配制聯(lián)合疫苗時(shí)，可產(chǎn)生病毒間或病毒亞型間的免疫干擾，其免疫應(yīng)答比單病毒組分疫苗的免疫應(yīng)答要低；由活疫苗配制的聯(lián)合疫苗，也可能發(fā)生組分間的重組反應(yīng)，可能使減毒活疫苗毒力回復(fù)。因此，在開展臨床試驗(yàn)前，應(yīng)對(duì)聯(lián)合疫苗中各組分間的相容性進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)采用適宜的理化、生化和生物學(xué)檢測(cè)方法，對(duì)制品的特性和組分的完整性進(jìn)行測(cè)定。為了進(jìn)一步證明組分間的相容性，在臨床前的研究中，應(yīng)采用適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型，確定聯(lián)合后對(duì)各組分的效力和免疫原性是否有影響。還應(yīng)當(dāng)考慮到聯(lián)合疫苗中的每一組分都有可能通過聯(lián)合使毒力回復(fù)。因此，應(yīng)當(dāng)測(cè)定組分在單價(jià)時(shí)和聯(lián)合時(shí)是否有恢復(fù)變異的趨勢(shì)。同時(shí)，還應(yīng)評(píng)價(jià)制品的再懸浮的影響，以及容器和瓶塞與聯(lián)合疫苗是否相匹配。

　　（二）防腐劑對(duì)聯(lián)合疫苗的影響

　　防腐劑或穩(wěn)定劑有可能改變疫苗的效力，如DTP-IPV中的硫柳汞可抑制IPV的效力；應(yīng)考慮防腐劑對(duì)組分毒性逆轉(zhuǎn)的影響，還應(yīng)考慮定量測(cè)定各成分或抗微生物物質(zhì)的殘余量，以及進(jìn)行防腐劑對(duì)成品抗污染能力的研究。

　　（三）佐劑對(duì)聯(lián)合疫苗的影響

　　應(yīng)研究佐劑與其他組分間的相容性及對(duì)每一成分的吸附度，同時(shí)還應(yīng)考慮多個(gè)組分若同時(shí)吸附時(shí)的吸附效率和動(dòng)力學(xué)。對(duì)于未被吸附（游離）的組分在配制后吸附情況，例如未被吸附的組分是否會(huì)被吸附；已吸附的組分是否會(huì)被解離下來，即研究存放時(shí)間對(duì)佐劑吸附抗原的影響等。對(duì)于以前未被吸附過的組分，應(yīng)研究吸附后對(duì)檢測(cè)方法和檢測(cè)結(jié)果是否會(huì)產(chǎn)生影響，應(yīng)了解對(duì)鑒別試驗(yàn)或熱原試驗(yàn)方面的影響。

　　（四）非活性成分對(duì)聯(lián)合疫苗的影響

　　在配方的開發(fā)階段，應(yīng)當(dāng)測(cè)定不同的緩沖液、鹽類、穩(wěn)定劑（比如乳糖、明膠、山梨醇等）以及其他化學(xué)因素是否對(duì)疫苗的安全性、純度或效力產(chǎn)生有害的相互作用。

　?。ㄎ澹┓€(wěn)定性和有效期

　　在穩(wěn)定性和有效期的研究時(shí)，應(yīng)使用三批成品考核實(shí)際貯存時(shí)間內(nèi)制品的穩(wěn)定性，以制定該制品的有效期。由于疫苗的有效期是從成品的效力試驗(yàn)開始計(jì)算的，所以還應(yīng)考慮以下三個(gè)方面對(duì)疫苗有效期的影響，即生產(chǎn)過程中和配制前每一組分的保存時(shí)間、效力試驗(yàn)開始前后的聯(lián)合疫苗的保存時(shí)間。聯(lián)合疫苗的有效期的開始時(shí)間應(yīng)當(dāng)是從測(cè)定聯(lián)合疫苗中的第一個(gè)組分的最后一次有效的效力試驗(yàn)開始（或合格）之日。按有效期最短的組分確定聯(lián)合疫苗的有效期，即應(yīng)綜合考慮各組分的有效期。所制定的成品有效期應(yīng)當(dāng)確保制品在其總有效期內(nèi)（即有效期開始前的貯存期加上成品的有效期）各組分都是穩(wěn)定和合格的。

二、聯(lián)合疫苗生產(chǎn)中應(yīng)考慮的問題

　　生產(chǎn)過程中應(yīng)考慮的主要問題是生產(chǎn)的一致性，即生產(chǎn)的穩(wěn)定性，應(yīng)證明在已確定的生產(chǎn)條件下生產(chǎn)出的產(chǎn)品是穩(wěn)定和一致的。

　?。ㄒ唬┻B續(xù)批的數(shù)量和規(guī)模

　　用于穩(wěn)定性研究的成品最好是用連續(xù)三批原液配制的，應(yīng)在規(guī)?；纳a(chǎn)設(shè)施中進(jìn)行，至少有一批是在大規(guī)模生產(chǎn)狀態(tài)下生產(chǎn)的，以表明該生產(chǎn)工藝在其生產(chǎn)規(guī)模改變時(shí)是否會(huì)對(duì)產(chǎn)品的安全、純度和效力產(chǎn)生影響，尤其對(duì)于吸附類產(chǎn)品和不易再懸浮的產(chǎn)品，其成品的質(zhì)量有可能受到吸附效率或者聯(lián)合步驟的影響。

　　（二）單價(jià)組分混合時(shí)應(yīng)考慮的問題

　　在配制聯(lián)合疫苗時(shí)每一種抗原應(yīng)至少使用三批，但對(duì)已獲生產(chǎn)文號(hào)的抗原（單價(jià)疫苗）可少于三批，沒有必要對(duì)聯(lián)合疫苗中所有組分的連續(xù)批進(jìn)行聯(lián)合配比的測(cè)定，但應(yīng)當(dāng)證明疫苗中每一抗原組分的生產(chǎn)一致性?？刹捎孟率雎?lián)合配比方法的距陣表或采用隨機(jī)采樣法，例如：X、Y、Z等組分配制的聯(lián)合疫苗可采用每一組分的第一批聯(lián)合后得到成品為第一批，即X1+Y1+Z1+……N1配制得到最終成品為批號(hào)1，X2+Y2+Z2+……N2配制得到最終成品為批號(hào)2，X3+Y3+Z3+……N3配制得到最終成品為批號(hào)3.采用這種方式配制可減少成品的批數(shù)。

三、聯(lián)合疫苗檢定中應(yīng)考慮的問題

　?。ㄒ唬┮话阋?/p>

　　對(duì)生產(chǎn)的每一批制品都要進(jìn)行檢測(cè)，證明其質(zhì)量達(dá)到了相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以保證制品在安全、純度和效力方面的質(zhì)量。如果目前尚無令人滿意的聯(lián)合疫苗檢測(cè)方法，應(yīng)盡快開發(fā)新的檢測(cè)方法，以測(cè)定每一種組分的含量或效價(jià)。

　　（二）效力試驗(yàn)

　　應(yīng)當(dāng)測(cè)定聯(lián)合疫苗中各有效組分的效力，其效價(jià)應(yīng)當(dāng)達(dá)到單價(jià)制品的規(guī)程要求。如果不能達(dá)到規(guī)程要求時(shí)，應(yīng)證明其效價(jià)降低是由于聯(lián)合疫苗中組分間的相互作用所致，并證明降低的效價(jià)不會(huì)導(dǎo)致人群免疫后低的免疫應(yīng)答。如果已經(jīng)證明后序的生產(chǎn)工藝對(duì)原液的效價(jià)沒有影響時(shí)，可以用對(duì)原液的效價(jià)測(cè)定代替對(duì)成品的效價(jià)測(cè)定，但凍干制品必需對(duì)成品進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。對(duì)含有佐劑的疫苗，抗原的吸附度對(duì)制品的效價(jià)會(huì)產(chǎn)生較大的影響，因此應(yīng)測(cè)定成品的效力。效力試驗(yàn)應(yīng)能證實(shí)組分間的相互作用使某一種組分對(duì)其他組分產(chǎn)生增強(qiáng)或減弱作用。效力試驗(yàn)可以用動(dòng)物免疫原性試驗(yàn)，對(duì)每一種抗原的免疫應(yīng)答以及應(yīng)答的質(zhì)量都應(yīng)進(jìn)行研究，這些研究應(yīng)當(dāng)包括測(cè)定抗體的分類、親和力、親和性、抗體動(dòng)態(tài)變化或功能，例如測(cè)定中和靶抗原或毒素的能力。最好是用動(dòng)物試驗(yàn)比較聯(lián)合疫苗與單個(gè)抗原的免疫應(yīng)答情況，以確定是否發(fā)生了免疫應(yīng)答的增強(qiáng)或抑制現(xiàn)象。同樣，也應(yīng)在動(dòng)物免疫原性研究中測(cè)定活疫苗株之間的免疫干擾現(xiàn)象。

　　對(duì)于一個(gè)新的疫苗或者聯(lián)合疫苗中含有人體未曾使用過的新抗原，只要有動(dòng)物模型，就應(yīng)當(dāng)首先用動(dòng)物模型對(duì)其保護(hù)力進(jìn)行研究。保護(hù)力試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)采用擬預(yù)防疾病的有毒株來攻擊。應(yīng)當(dāng)按照經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)和經(jīng)科學(xué)驗(yàn)證的試驗(yàn)步驟對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，并應(yīng)詳細(xì)描述。此項(xiàng)試驗(yàn)應(yīng)在產(chǎn)品的開發(fā)早期進(jìn)行。

　?。ㄈ╄b別試驗(yàn)

　　應(yīng)對(duì)聯(lián)合疫苗中每一活性組分進(jìn)行檢定，目的是證明制品的內(nèi)容物與其標(biāo)簽的標(biāo)示相一致。

　?。ㄋ模o菌檢查

　　聯(lián)合疫苗中的各組份以及成品疫苗均應(yīng)符合無菌試驗(yàn)的要求。對(duì)含有殘余抗生素、含有未曾使用過的防腐劑或含有顆粒狀佐劑的制品，對(duì)其半成品和成品的無菌試驗(yàn)應(yīng)進(jìn)行研究，并建立適宜于這些制品的無菌試驗(yàn)方法。

　?。ㄎ澹┘兌仍囼?yàn)

　　聯(lián)合疫苗中每一種組分均應(yīng)達(dá)到該組分的純度要求，如Hib－DTP偶聯(lián)疫苗中的Hib組分，即使與已知含有內(nèi)毒素的DTP配制成聯(lián)合疫苗，也應(yīng)當(dāng)符合Hib制品熱原試驗(yàn)的要求。在此種情況下則不要求對(duì)成品進(jìn)行熱原檢查。此外，對(duì)組分進(jìn)行純度測(cè)定用的SDS-PAGE檢測(cè)，也不適用于成品。

四、聯(lián)合疫苗臨床研究中應(yīng)注意的問題

　　聯(lián)合疫苗的臨床研究與其他疫苗一樣首先應(yīng)遵循《藥品臨床試驗(yàn)管理規(guī)范》（GCP）的要求。由于聯(lián)合疫苗是多組分的，在臨床研究中對(duì)于安全性和有效性的研究與單一成分的疫苗有所不同，應(yīng)注意以下幾方面的問題。

　?。ㄒ唬┌踩匝芯?/p>

　　一般來講，聯(lián)合疫苗的安全性研究是與同時(shí)在不同部位接種聯(lián)合疫苗中的每一種單價(jià)組分疫苗進(jìn)行比較，例如，接種DTP-HB疫苗與分別接種DTP和HB疫苗進(jìn)行比較。臨床試驗(yàn)應(yīng)是隨機(jī)的，且應(yīng)設(shè)對(duì)照組，如分別在不同部位同時(shí)注射聯(lián)合疫苗中所含有的單價(jià)組份疫苗的對(duì)照。

　　臨床試驗(yàn)中應(yīng)觀察接種后的不良反應(yīng)，還應(yīng)進(jìn)行跟蹤研究，應(yīng)在臨床研究開始前確定不良反應(yīng)的判定標(biāo)準(zhǔn)和跟蹤研究方案。一般滅活疫苗應(yīng)進(jìn)行7天的主動(dòng)監(jiān)測(cè)，活疫苗應(yīng)進(jìn)行14天以上的主動(dòng)監(jiān)測(cè)，還應(yīng)進(jìn)行30 天電話隨訪或采用調(diào)查表的方式。觀察的不良反應(yīng)包括全身反應(yīng)如：發(fā)熱、不適、頭疼、嘔吐、哭鬧，及紅斑、硬結(jié)、疼痛、 觸痛等局部反應(yīng)；以及不常見或罕見的不良反應(yīng)。

　?。ǘ┟庖咴匝芯?/p>

　　應(yīng)當(dāng)對(duì)聯(lián)合疫苗中所有組分的免疫原性進(jìn)行研究。應(yīng)當(dāng)將聯(lián)合疫苗的免疫原性與分別同時(shí)接種在不同部位的各單價(jià)組分疫苗的免疫原性進(jìn)行比較，如果聯(lián)合疫苗中的某些組分是已獲生產(chǎn)文號(hào)的，那么，該已獲得文號(hào)的單組份疫苗可以用于免疫原性研究的對(duì)照組。聯(lián)合疫苗中的每一種血清型或組分在聯(lián)合疫苗中均應(yīng)有相應(yīng)的免疫原性要求。在臨床試驗(yàn)方案中應(yīng)包含各組分免疫原性與其保護(hù)性之間關(guān)系研究的要求。

　　評(píng)價(jià)每一組分的免疫原性的參數(shù)是非常關(guān)鍵的，應(yīng)廣泛征求有關(guān)專家的意見，確定評(píng)價(jià)疫苗免疫原性的參數(shù)以及各參數(shù)的合格標(biāo)準(zhǔn)。一般來講，抗體水平和血清陽轉(zhuǎn)對(duì)于臨床保護(hù)性只起一定的參考作用。應(yīng)當(dāng)注重抗體的質(zhì)量而不是僅僅是抗體的量，例如，抗體的親和性、功能、抗原決定族的識(shí)別位點(diǎn)以及其他規(guī)定的參數(shù)對(duì)確定應(yīng)答抗體的質(zhì)量是非常重要的。

　　免疫原性比較研究的目的旨在證明聯(lián)合疫苗接種后各組份疫苗的免疫應(yīng)答與同時(shí)分別接種聯(lián)合疫苗中的各單組份疫苗后的免疫應(yīng)答之間是否有顯著區(qū)別。研究的設(shè)計(jì)應(yīng)能證明聯(lián)合疫苗與原單價(jià)疫苗的免疫原性相一致，應(yīng)能證明和排除在臨床上抗體幾何平均滴度（GMTs）和/或者血清陽轉(zhuǎn)率方面的顯著性差別，同時(shí)應(yīng)考慮測(cè)定方法和受試者的內(nèi)在變化的影響。臨床試驗(yàn)方案中應(yīng)對(duì)聯(lián)合疫苗接種后各單組份疫苗的免疫應(yīng)答與直接接種單組份疫苗的免疫應(yīng)答可能存在的顯著差別作出明確的定義，在試驗(yàn)假設(shè)中應(yīng)清楚地表明哪些差別是將被排除的，并且以此來計(jì)算出受試人群的大小。應(yīng)當(dāng)對(duì)任何觀測(cè)到的差別評(píng)價(jià)其臨床相關(guān)性，對(duì)每一個(gè)組分在免疫劑量或免疫程序上的改變，均應(yīng)有臨床數(shù)據(jù)作為其改變的依據(jù)。

　　用于臨床驗(yàn)證的制品批數(shù)可以比用于生產(chǎn)一致性研究的批數(shù)少。但是，在某些情況下，例如制品中含有未獲生產(chǎn)文號(hào)的組分時(shí)，臨床驗(yàn)證時(shí)應(yīng)使用更多的批數(shù)，應(yīng)至少有一批是用于生產(chǎn)一致性研究的制品，并且，應(yīng)采用制備聯(lián)合疫苗的同批單價(jià)疫苗進(jìn)行接種的對(duì)照組試驗(yàn)，以避免由于批間的不同而引起免疫原性的不同。對(duì)所使用的疫苗批間的差異要進(jìn)行分析。因此，臨床試驗(yàn)也應(yīng)考慮以上因素對(duì)臨床研究結(jié)果的影響。

　?。ㄈ┯行匝芯?/p>

　　每一組分的有效性均應(yīng)經(jīng)過臨床試驗(yàn)得到證明。比較理想的臨床試驗(yàn)是前瞻性的、隨機(jī)的和有對(duì)照的。評(píng)價(jià)有效性所使用的判定終點(diǎn)，一般是疾病的發(fā)病率，但也可以是已經(jīng)確定了的“保護(hù)性相關(guān)指標(biāo)”。疫苗有效性試驗(yàn)中所使用的保護(hù)性相關(guān)指標(biāo)，應(yīng)為經(jīng)過充分驗(yàn)證的和臨床試驗(yàn)證明的可以保護(hù)該疾病的實(shí)驗(yàn)室參數(shù)。如果一個(gè)免疫學(xué)的保護(hù)性相關(guān)指標(biāo)在能夠確定質(zhì)和量的相互關(guān)系時(shí)，就可以代替流行病學(xué)指標(biāo)。具有一定滴度的某些類別的抗體與保護(hù)性具有相關(guān)性，例如免疫后破傷風(fēng)抗毒素的中和抗體單位大于0.01IU/ml時(shí)，則認(rèn)為可保護(hù)受試者免于破傷風(fēng)的發(fā)生。

　　如果聯(lián)合疫苗中的單組分疫苗的保護(hù)性效力是經(jīng)過證實(shí)的，這一研究結(jié)果可以作為參考資料來支持聯(lián)合疫苗的研發(fā)。在臨床試驗(yàn)時(shí)，可采用與單價(jià)組份疫苗的橋接試驗(yàn)來比較聯(lián)合疫苗中這組份疫苗的保護(hù)性效力。

　　如果聯(lián)合疫苗免疫后產(chǎn)生的抗體水平低于單價(jià)組分疫苗，但仍能達(dá)到保護(hù)性作用的，應(yīng)提供相應(yīng)的數(shù)據(jù)或資料證明其保護(hù)的有效性及持久性。

　　在評(píng)價(jià)制品有效性時(shí)，一般不選用病例對(duì)照試驗(yàn)（case-control）。由于該試驗(yàn)在許多方面有可能產(chǎn)生偏差，因此，在采用該方法時(shí)，應(yīng)在試驗(yàn)方案中詳盡地闡述如何降低偏差和采取的糾正措施。

　　一般來說，測(cè)定多價(jià)血清型的聯(lián)合疫苗中每一個(gè)血清型的效力是比較困難的。因此可采用相應(yīng)的替代方案。應(yīng)當(dāng)根據(jù)目標(biāo)人群中相應(yīng)血清型疾病的發(fā)病率設(shè)計(jì)此類疫苗有效性的臨床試驗(yàn)。如果臨床試驗(yàn)的判定終點(diǎn)是以該疫苗所預(yù)防的各型疾病發(fā)病率的總和時(shí)，該試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)具有相當(dāng)?shù)囊?guī)模，即確保發(fā)病率低的血清型仍能有一定數(shù)量人群的數(shù)據(jù)，以評(píng)價(jià)其有效性。

　　對(duì)于多價(jià)血清型的聯(lián)合疫苗，由于缺乏足夠數(shù)量的病例而不能夠進(jìn)行臨床有效性的評(píng)價(jià)時(shí)，在某些情況下，可以用免疫原性的數(shù)據(jù)推斷其有效性。如果在臨床上已經(jīng)證明了血清學(xué)和有效性存在著相關(guān)關(guān)系時(shí)，可以使用免疫原性數(shù)據(jù)推斷其有效性。

　?。ㄋ模?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

　　臨床研究中很重要的一個(gè)問題是確定受試人群的大小?，F(xiàn)在尚無計(jì)算聯(lián)合疫苗臨床試驗(yàn)受試人群大小的標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)主要基于統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床學(xué)和基礎(chǔ)科學(xué)的評(píng)價(jià)結(jié)果。

　　多數(shù)聯(lián)合疫苗的臨床試驗(yàn)均以在不同部位分別接種各組分疫苗或接種各組份混合后疫苗為試驗(yàn)的對(duì)照組，受試者應(yīng)當(dāng)隨機(jī)地分配到各疫苗組。按照受試者的特性（如：年齡或者到達(dá)試驗(yàn)點(diǎn)的日期）分組的方法不符合隨機(jī)分配的原則。

　　為了證明聯(lián)合疫苗與單價(jià)疫苗等效性的臨床試驗(yàn)，應(yīng)當(dāng)設(shè)計(jì)一個(gè)拒絕有區(qū)別的假設(shè)試驗(yàn)，而不是傳統(tǒng)意義上的無區(qū)別的“無效”假設(shè)試驗(yàn)。為了證明發(fā)生率和比例相同或等價(jià)時(shí)，采用單側(cè)檢驗(yàn)是適宜的，因臨床試驗(yàn)的目的在于證明注射聯(lián)合疫苗與分別注射的單價(jià)組分疫苗無明顯差異。

　　如果要證明聯(lián)合疫苗優(yōu)于分別注射的單價(jià)組分疫苗，應(yīng)當(dāng)設(shè)計(jì)一個(gè)檢驗(yàn)差異的臨床試驗(yàn)，而不是一個(gè)檢驗(yàn)等價(jià)的試驗(yàn)。

　　對(duì)于免疫應(yīng)答，一般分析接種后的GMT或GMR（應(yīng)答率的幾何均值），通常是為了排除聯(lián)合疫苗和分別注射的單價(jià)組分疫苗間在臨床上有意義的差別。對(duì)于要排除事先規(guī)定的差別的臨床試驗(yàn)規(guī)模，應(yīng)計(jì)算考慮受試人群的大小。

　　如果聯(lián)合疫苗的免疫應(yīng)答未顯示明顯地低于分別注射的單價(jià)疫苗，那么，可采用雙側(cè)的生物等價(jià)檢驗(yàn)來分析GMT.理想的設(shè)計(jì)是聯(lián)合疫苗誘導(dǎo)所產(chǎn)生的抗體滴度既不比預(yù)先規(guī)定的量太低也不會(huì)太高。

　　臨床結(jié)果分析時(shí)，應(yīng)同時(shí)進(jìn)行血清的陽轉(zhuǎn)率與抗體滴度的分析比較研究。在沒有保護(hù)性替代指標(biāo)的情況下，如果沒有陽轉(zhuǎn)率與GMT間的分析和評(píng)價(jià)是很難得出結(jié)論。如果已經(jīng)建立了保護(hù)性免疫的替代指標(biāo)，在評(píng)價(jià)聯(lián)合疫苗和分別注射的單價(jià)組分疫苗間的差別時(shí)，就應(yīng)當(dāng)考慮保護(hù)性免疫替代指標(biāo)。

　　對(duì)于評(píng)價(jià)常見的不良反應(yīng)，試驗(yàn)組中聯(lián)合疫苗為一個(gè)接種部位，而對(duì)照組為二個(gè)或多個(gè)接種部位，這種對(duì)比分析試驗(yàn)不是雙盲的。因此，在分析時(shí)應(yīng)將單部位接種的反應(yīng)（聯(lián)合疫苗組）與多部位接種（對(duì)照組）當(dāng)中反應(yīng)最嚴(yán)重的一點(diǎn)進(jìn)行比較。還應(yīng)考慮到在個(gè)體內(nèi)的不同組分間的相互作用。

　　對(duì)于不常見的不良反應(yīng)的評(píng)價(jià)，臨床試驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)疫苗目標(biāo)人群的大小來確定受試人群的大小。

　　對(duì)于罕見的不良反應(yīng)的評(píng)價(jià)，受試人群的規(guī)模應(yīng)當(dāng)足夠大，如果未觀察到不良反應(yīng)，可認(rèn)為在目標(biāo)人群中發(fā)生的可能性也很低。

　　總之，聯(lián)合疫苗的研發(fā)和臨床試驗(yàn)不同于一般疫苗，除一般要求以外，還應(yīng)充分考慮多種組分聯(lián)合后產(chǎn)生的相互作用對(duì)聯(lián)合后疫苗的安全性和有效性的影響，以及是否產(chǎn)生毒性逆轉(zhuǎn)或重組。在臨床試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用聯(lián)合疫苗中各組分分別但同時(shí)接種作為對(duì)照組，由于對(duì)照組是多部位接種，給不良反應(yīng)的評(píng)價(jià)帶來了困難，同時(shí)還應(yīng)充分考慮各組分在體內(nèi)的相互作用而產(chǎn)生的影響。因此，不能簡(jiǎn)單地采用一種固定的模式研究聯(lián)合疫苗的安全性和有效性。

多肽疫苗生產(chǎn)及質(zhì)控技術(shù)指導(dǎo)原則

前言

　　多肽疫苗是按照病原體抗原基因中已知或預(yù)測(cè)的某段抗原表位的氨基酸序列，通過化學(xué)合成技術(shù)制備的疫苗。傳統(tǒng)疫苗一般由兩種方式制備，一種為能誘發(fā)免疫力卻不致病的減毒疫苗，例如黃熱病、脊髓灰質(zhì)炎和麻疹疫苗或卡介苗；另一種為滅活疫苗（例如百日咳桿菌、狂犬病毒、傷寒桿菌）。多肽疫苗由于完全是合成的，不存在毒力回升或滅活不全的問題。特別是一些還不能通過體外培養(yǎng)方式獲得足夠量的抗原的微生物病原體。有些雖能進(jìn)行體外培養(yǎng)，但這些病原體有潛在致病性和免疫病理作用等涉及安全性與有效性的問題。多肽作為體內(nèi)引起效應(yīng)細(xì)胞免疫應(yīng)答形成的免疫原，將成為一種新型的疫苗，但還有很多理論和技術(shù)問題要繼續(xù)研究，目前尚無多肽疫苗獲準(zhǔn)上市。因此，應(yīng)采取適當(dāng)可行的途徑對(duì)這種潛能疫苗進(jìn)行生產(chǎn)及質(zhì)控，并在其生產(chǎn)過程中積累經(jīng)驗(yàn)，為此，應(yīng)加強(qiáng)咨詢和論證，以便提出一個(gè)確保安全有效而又適合實(shí)際的申報(bào)資料。同時(shí)，對(duì)每個(gè)方案中各個(gè)階段的操作過程、中間及最終產(chǎn)品的制備，務(wù)必制定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，并予嚴(yán)格實(shí)施。

一、多肽疫苗的化學(xué)合成

　　首先應(yīng)該確定天然抗原的氨基酸序列，選擇和確定尋找有效肽段的方法，并尋找該肽段所針對(duì)的抗原決定簇。

　　其次應(yīng)選擇合適的合成方法。合成中等大小的多肽也會(huì)涉及眾多反應(yīng)，每加入一個(gè)氨基酸需多次反應(yīng)，在一個(gè)氨基酸的α氨基與另一個(gè)氨基酸的羧基縮合形成肽鏈之前，必須使其中一個(gè)形成高反應(yīng)的活化狀態(tài)，這個(gè)選擇自然落到羧基上，合成因而從C到N端。如果A氨基酸的C端與B氨基酸的N端縮合產(chǎn)生2肽A－B，則A的N端及B的C端必須保護(hù)起來，才能轉(zhuǎn)化成在A－B之間形成特異性肽的形式。此外，氨基肽的側(cè)鏈基團(tuán)也能與活化羧基反應(yīng)，因此也必須保護(hù)起來。這些側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)必須能耐受除去α－氨基保護(hù)基團(tuán)的條件，這樣才能生成新的氨基基團(tuán)使肽鏈得以繼續(xù)延長(zhǎng)。合成結(jié)束后必須除去所有的保護(hù)性基團(tuán)以得到所需的多肽。多肽的合成循環(huán)包括了一系列的反應(yīng)，每一循環(huán)生成一個(gè)新肽鍵。

　　主要有兩個(gè)合成策略：片段濃縮法和固相合成法（merrifield法）。片段濃縮法是經(jīng)典的

　　合成技術(shù)。首先合成數(shù)條小肽，經(jīng)純化和去保護(hù)后結(jié)合成較長(zhǎng)的肽，直到最后所需的序列。

　　在固相合成法是將肽鏈一端結(jié)合于固相載體上的方法。通過在N－末端逐步加上氨基酸的方法合成肽段。

　　另外也引入一些新進(jìn)展包括改良的保護(hù)基因、新的固相載體、脫保護(hù)及側(cè)鏈功基保護(hù)等新方法。在疫苗合成領(lǐng)域中，由于肽鏈聯(lián)接或裝配到需要的結(jié)構(gòu)（TADPs）及免疫原性構(gòu)架（MAPs）所用技術(shù)的引進(jìn)，加上肽鏈經(jīng)脂質(zhì)或碳水化合物的修飾作用，使得合成問題變得更加復(fù)雜。目前多應(yīng)用固相法，特別是在選擇和確定有效抗原表位研究方面，是合成多肽疫苗的一條可供選擇的途徑。

二、多肽疫苗的生產(chǎn)工藝及質(zhì)控

　?。ㄒ唬?yīng)提供研制某一疫苗的詳細(xì)資料，包括選擇特定抗原決定簇的理由、對(duì)抗原決定簇的檢定，以及對(duì)載體、表位連接、結(jié)合劑、肽的呈遞方式及佐劑等的選擇理由及其相應(yīng)證據(jù)。

　?。ǘ?yīng)說明每條肽段所針對(duì)的抗原表位。內(nèi)容包括對(duì)每個(gè)表位來源的說明，當(dāng)不止一個(gè)表位時(shí)，應(yīng)說明把不同表位相互結(jié)合到一個(gè)已知序列內(nèi)的理由，此外還應(yīng)對(duì)表位的類型（B、Th、Tc等）及特殊組合方式進(jìn)行說明。

　?。ㄈ?yīng)當(dāng)提供肽鏈合成的詳細(xì)資料。內(nèi)容包括：原料的來源和特性、使用的方法學(xué)、氨基酸的連接和脫保護(hù)，進(jìn)入下一步連接的判斷標(biāo)準(zhǔn)，任何加入的修飾基團(tuán)（例如糖基化，脂質(zhì)化）的詳細(xì)情況。如果采用了液體合成法，應(yīng)當(dāng)提供包括對(duì)中間體有特殊說明的流程圖。

　?。ㄋ模┤绻膯误w為中間產(chǎn)物，應(yīng)當(dāng)對(duì)其分離鑒定并提供下述確證依據(jù)。

　　1．主要肽順序與預(yù)期的結(jié)構(gòu)相同，例如，目標(biāo)氨基酸按需要的順序排列；修飾（脂化及糖基化）情況；

　　2．對(duì)肽單體中的主要雜質(zhì)（可能情況下對(duì)次要雜質(zhì)）應(yīng)分離鑒定。驗(yàn)證純度時(shí)應(yīng)采用多種技術(shù)對(duì)其理化特性盡可能多地檢查，特別要注意檢測(cè)生產(chǎn)或純化過程中可能加入的物質(zhì)；

　　3．連續(xù)多批產(chǎn)品的肽質(zhì)量應(yīng)保持一致。

　?。ㄎ澹?duì)肽單體或肽衍生物應(yīng)建立適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)。對(duì)肽的純度、總雜質(zhì)、每種主要及次要雜質(zhì)都應(yīng)規(guī)定限度要求。

　　（六）如果不能對(duì)肽單體進(jìn)行全面鑒定，應(yīng)提供相應(yīng)說明。

　?。ㄆ撸?yīng)對(duì)肽的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并制定適當(dāng)?shù)馁A存期。

　?。ò耍┡悸?lián)物

　　偶聯(lián)物中多肽及其它成分除了達(dá)到適當(dāng)?shù)囊笸?，還應(yīng)符合下列規(guī)定：

　　1．對(duì)偶聯(lián)物進(jìn)行驗(yàn)證，其含量應(yīng)能重復(fù)并保持一致，當(dāng)不止一種肽結(jié)合到同一載體上時(shí)，應(yīng)對(duì)每一種肽所占比例進(jìn)行控制并能重復(fù)制備；

　　2．最大限度降低副反應(yīng)并控制到能重復(fù)的水平，這些副反應(yīng)包括載體之間的交聯(lián)，載體表面濃縮的未結(jié)合的偶聯(lián)劑，以及對(duì)未參與結(jié)合的偶聯(lián)劑的滅活等；

　　3．有證據(jù)表明偶聯(lián)物未改變抗原序列；

　　4．應(yīng)當(dāng)考慮機(jī)體對(duì)載體蛋白或其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的潛在臨床影響；

　　5．當(dāng)同一載體用于幾種疫苗或一種疫苗的幾種不同表位時(shí)，應(yīng)考慮特異性表位抑制的可能性，并進(jìn)行調(diào)查；

　　6．應(yīng)當(dāng)最大限度地降低殘余溶劑或副產(chǎn)品的含量，并設(shè)定相應(yīng)限定要求；

　　7．應(yīng)當(dāng)設(shè)定適宜的可接受的標(biāo)準(zhǔn)，合適的參考制品可能是必要的。

　?。ň牛┹d體

　　肽可以聯(lián)接或結(jié)合到載體上，選擇載體時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎，因?yàn)閷?duì)載體的免疫應(yīng)答可能會(huì)掩蔽對(duì)肽的免疫應(yīng)答。目標(biāo)人群中的一部分可能對(duì)某一載體存在過敏反應(yīng)或某些載體有刺激自身免疫的危險(xiǎn)，應(yīng)避免選擇這些載體。載體應(yīng)有自已的檔案材料及相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，它包括：載體的鑒定，生產(chǎn)一致性的證據(jù)，蛋白質(zhì)的安全性以及與蛋白質(zhì)、脂多糖、多聚體、脂質(zhì)體等相關(guān)的一些特征試驗(yàn)。例如，聚合體和脂多糖應(yīng)當(dāng)具有可重復(fù)的分子量范圍，脂多糖具有一致的單糖組分，脂質(zhì)體具有一致的結(jié)構(gòu)、組分。對(duì)不同成分及雜質(zhì)應(yīng)鑒別定性并加以定量測(cè)定，對(duì)于生物來源的載體應(yīng)當(dāng)采取措施，確保檢測(cè)不出感染因子。

　?。ㄊ┚酆?、烷化或載體合成肽

　　無論是與聚合肽構(gòu)架（例如MAP）結(jié)合的肽，或肽單體合成后再進(jìn)一步形成的聚合肽或烷化肽（例如，通過未端半胱氨酸的氧化作用），也無論是單一肽鏈或與其它肽鏈的聚合，都應(yīng)有相應(yīng)的證據(jù)，表明反應(yīng)過程達(dá)到了最后可重復(fù)的階段。

　　（十一）佐劑、防腐劑及其他添加成分為方便操作、增強(qiáng)穩(wěn)定性、延長(zhǎng)保存期以及修飾免疫原的類型和免疫原性，原則上可在免疫原中選擇添加許多成分。這些成分其特性變化較大，從小分子物質(zhì)到大分子菌體成分及合成聚合物等各不相同，有作為非特異免疫增強(qiáng)劑的成分，特異性免疫激活作用的成分及直接作用于不同免疫細(xì)胞的成分。其中許多會(huì)產(chǎn)生自身的毒性，而且可能因與抗原聯(lián)合使用而顯著改變免疫反應(yīng)，從而引起安全性方面的其它顧慮。傳統(tǒng)佐劑是在礦物膠基礎(chǔ)上制成-氫氧化鋁、磷酸鋁或磷酸鈣，到目前為止批準(zhǔn)使用的佐劑鮮為他類。對(duì)已獲批準(zhǔn)的以鋁鹽及鈣鹽為基礎(chǔ)的佐劑，其標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)達(dá)到藥用等級(jí)（不含重金屬離子，質(zhì)量恒定，具有恒定的結(jié)合特征）。由于滅菌可能會(huì)改變佐劑的結(jié)合特征，對(duì)不同批次佐劑應(yīng)以可重復(fù)、持續(xù)的方式處理。對(duì)于添加劑，應(yīng)提供所有成分的明確說明，闡述使用的理由。每種成分應(yīng)具有適當(dāng)?shù)姆治鰳?biāo)準(zhǔn)要求，終配方中應(yīng)限定不同成分混合物的含量。此外，應(yīng)全面評(píng)價(jià)配方的抗原及毒性特征，特別注意不同成分的混合可能會(huì)導(dǎo)致抗原發(fā)生不良的修飾作用。

　　如果在疫苗中加入防腐劑，應(yīng)確定其含量，該用量應(yīng)既不對(duì)疫苗中的各個(gè)成分產(chǎn)生不良作用，也不應(yīng)引起人體副反應(yīng)。單劑量制劑不應(yīng)添加防腐劑。

　　（十二）穩(wěn)定性

　　進(jìn)行充分的穩(wěn)定性研究是研制疫苗的一項(xiàng)重要內(nèi)容。因此應(yīng)確定配方的穩(wěn)定性，并以此建立合適貯存條件下的最大貨架期。為確保每種成分的有效性，應(yīng)對(duì)到期產(chǎn)品的免疫原性及安全性進(jìn)行實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究。

三、產(chǎn)品的質(zhì)量與檢定要求

　　保證多肽制品的一致性極其重要，應(yīng)廣泛使用分析技術(shù)。應(yīng)對(duì)疫苗生產(chǎn)工藝的各個(gè)環(huán)節(jié)和步驟的各種成分（無論以單獨(dú)或偶聯(lián)方式）均應(yīng)建立相應(yīng)的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)，包括原材料質(zhì)控，加工過程的質(zhì)控和終產(chǎn)品的質(zhì)控，以保證終產(chǎn)品安全有效。

　　除應(yīng)符合常規(guī)的安全試驗(yàn)（如無菌、熱原試驗(yàn)及異常毒性試驗(yàn)），針對(duì)合成多肽的特點(diǎn)應(yīng)考慮：

　?。ㄒ唬┘兌龋焊咝б合嗌V（HPLC）、毛細(xì)管電泳（CE）、陽離子或陰離子色譜、等電聚焦，依據(jù)分子大小的鑒別技術(shù)（分子篩層析，還原、非還原SDS－PAGE 電泳），根據(jù)疏水性的鑒別技術(shù)（反相或疏水作用層析）等相應(yīng)分析的技術(shù)。

　?。ǘ├砘再|(zhì)均一性的確定：氨基酸序列分析（N/C末端）、肽圖、MS以及氨基酸組成（AAA）分析。

　?。ㄈ┊a(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)

　?。ㄋ模┡c生產(chǎn)過程相關(guān)的雜質(zhì)

　?。ㄎ澹┤藶樾揎椀臋z測(cè)

　　（六）效力試驗(yàn)

　　效力試驗(yàn)并非一定反映出在人體內(nèi)的作用機(jī)制或功能活動(dòng)。但是在合適情況下應(yīng)包括有關(guān)疫苗功能的適宜試驗(yàn)。效力試驗(yàn)的主要目的是通過測(cè)定生物活性的方法，確認(rèn)各批之間的一致性。因此應(yīng)考慮活體外及活體內(nèi)免疫性和抗原性測(cè)定試驗(yàn)。這種試驗(yàn)應(yīng)將制品同時(shí)與參考品做比較，而且試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。由于疫苗的作用模式會(huì)改變，有關(guān)這類試驗(yàn)的細(xì)節(jié)應(yīng)區(qū)別對(duì)待，不能一概而論。但是應(yīng)確定試驗(yàn)結(jié)果的可信限，以便確定方法本身固有的變異，為每批制品的平均值提供一個(gè)可信限幅度，并由此確定接受的標(biāo)準(zhǔn)及限值，為此應(yīng)建立適宜的參考制劑。

　?。ㄆ撸┥镄r(jià)測(cè)定

　?。ò耍┙?nèi)部參考品：建立適當(dāng)?shù)膮⒖计穼?duì)實(shí)現(xiàn)這些標(biāo)準(zhǔn)也是必要的。此外，選取合適的一批中間產(chǎn)品及終產(chǎn)品（最好是選擇經(jīng)過臨床評(píng)價(jià)的制品），就其化學(xué)成分、純度及生物學(xué)活性進(jìn)行全面檢定，而后保存下來作為化學(xué)或生物參考品，可依此制定每批產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)要求。

　?。ň牛┳魟?、保護(hù)劑及其他添加成分：如果使用鋁或鈣的化合物作為佐劑，其用量不應(yīng)超過常規(guī)用量范圍（每人用劑量的鋁佐劑含量應(yīng)不超過1.25mg，鈣佐劑含量應(yīng)不超過1.3mg）。對(duì)保護(hù)劑及其他添加劑應(yīng)確定相應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

四、臨床前安全評(píng)價(jià)

　　臨床前安全評(píng)價(jià)的主要目的是確定新藥制品是否引起意外或不良的效應(yīng)。但推薦供化學(xué)藥使用的臨床安全及毒性試驗(yàn)對(duì)于合成肽疫苗不甚相關(guān)。動(dòng)物毒性試驗(yàn)會(huì)產(chǎn)生種屬特異性方面的問題，因此，多肽疫苗的安全評(píng)價(jià)應(yīng)考慮諸多因素。有必要采取靈活的方法評(píng)價(jià)合成肽疫苗的臨床前安全性，應(yīng)當(dāng)充分考慮使用合成肽疫苗所產(chǎn)生不良免疫病理反應(yīng)的各種可能性。

　　必須確保使用的肽序列不具有明顯的不良藥理活性。因此，應(yīng)篩查單體肽固有的毒性或藥理作用。也應(yīng)考慮由聚合或偶合而產(chǎn)生的作用的可能性。一種多肽可能有意想不到的次要活性，而這一活性可能會(huì)由于上述反應(yīng)而得到放大并產(chǎn)生危害。因此，應(yīng)全面檢查多肽及其偶合物的藥理活性。

　　抗肽抗體可能與人體組織產(chǎn)生意想不到的交叉反應(yīng)，也可引發(fā)自身免疫反應(yīng)。因此，應(yīng)使用人體組織測(cè)定疫苗的最后配方及佐劑是否產(chǎn)生意外的交叉抗體。偶合或聚合反應(yīng)能產(chǎn)生新的表位，而僅僅評(píng)價(jià)肽單體不能解決該問題。毫無疑問安全試驗(yàn)是必要的，但選擇何種試驗(yàn)則應(yīng)依靠實(shí)際情況而定，并應(yīng)咨詢有關(guān)質(zhì)控當(dāng)局。對(duì)于臨床前安全性試驗(yàn)，應(yīng)廣泛使用生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、毒理學(xué)及組織病理學(xué)等適當(dāng)?shù)难芯考夹g(shù)，在適當(dāng)?shù)那闆r下，可采用多個(gè)相關(guān)劑量并包括急性及慢性試驗(yàn)。

結(jié)合疫苗質(zhì)量控制和臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則

前言

　　結(jié)合（以蛋白為載體的細(xì)菌多糖類）疫苗是指采用化學(xué)方法將多糖共價(jià)結(jié)合在蛋白載體上所制備成的多糖-蛋白結(jié)合疫苗，用于提高細(xì)菌疫苗多糖抗原的免疫原性，如b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗、腦膜炎球菌結(jié)合疫苗和肺炎球菌結(jié)合疫苗等。結(jié)合疫苗的生產(chǎn)及質(zhì)量控制應(yīng)符合國(guó)家有關(guān)規(guī)定和中國(guó)藥品GMP要求。其制造及檢定方法的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范、驗(yàn)證和修訂應(yīng)獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)或認(rèn)可。

　　本原則適用于多糖-蛋白結(jié)合疫苗生產(chǎn)的質(zhì)量控制和臨床研究。

　　應(yīng)根據(jù)疫苗生產(chǎn)用菌種的生物安全防護(hù)等級(jí)分類，在相應(yīng)的生物安全防護(hù)條件下進(jìn)行各項(xiàng)生產(chǎn)用菌種的操作。生產(chǎn)操作和質(zhì)量檢驗(yàn)人員必須經(jīng)過嚴(yán)格的職業(yè)培訓(xùn)，并應(yīng)采取適宜的防護(hù)措施，例如免疫接種相應(yīng)的疫苗。必須制訂詳細(xì)的和切實(shí)可行的緊急處理措施，確保一旦發(fā)生細(xì)菌溢出、滲漏等其它細(xì)菌播散事故時(shí)，可最大限度地控制和避免危害人身和環(huán)境的安全。

一、結(jié)合疫苗生產(chǎn)的質(zhì)量控制原則

　?。ㄒ唬┒嗵强乖a(chǎn)的質(zhì)量控制

　　1．生產(chǎn)用菌種和培養(yǎng)基：生產(chǎn)用菌種須經(jīng)國(guó)家食品藥品管理當(dāng)局批準(zhǔn)方可用于制備多糖抗原。應(yīng)采用種子批系統(tǒng)。從原始種子批傳代、擴(kuò)增后凍干保存為主種子批。從主種子批制備工作種子批。主種子批和工作種子批菌種的各種特性應(yīng)與原始種子批一致。工作種子批用于生產(chǎn)。應(yīng)驗(yàn)明各級(jí)菌種庫菌種的記錄、來源、歷史和生物學(xué)特性，并進(jìn)行各項(xiàng)必需的生物學(xué)特性鑒定。如：形態(tài)、培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)和血清學(xué)試驗(yàn)等。必要時(shí)可采用核磁共振（1H或13C）、核苷酸序列分析等特殊鑒定方法。

　　培養(yǎng)基成分應(yīng)盡可能避免使用動(dòng)物源性材料，禁止使用來自瘋牛病疫區(qū)的牛源性材料。

　　應(yīng)通過監(jiān)測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)速度、pH值和多糖的產(chǎn)量，保證不同批或不同培養(yǎng)罐中細(xì)菌生長(zhǎng)的均一性。

　　應(yīng)在培養(yǎng)過程中及殺菌前取樣進(jìn)行純菌試驗(yàn)，可采用革蘭氏染色鏡檢和平皿劃線接種培養(yǎng)等。若發(fā)現(xiàn)染有雜菌應(yīng)廢棄。

　　2．精制純化多糖：精制純化多糖應(yīng)逐批進(jìn)行鑒別試驗(yàn)、純度和分子大小測(cè)定。應(yīng)制定多糖純度的合格標(biāo)準(zhǔn)。通常應(yīng)在－20℃以下儲(chǔ)存精制純化后的多糖，以維持其穩(wěn)定性。為控制精制純化多糖的質(zhì)量所進(jìn)行的測(cè)定包括：

　?。?）鑒別試驗(yàn)：通常應(yīng)用血清學(xué)反應(yīng)進(jìn)行多糖鑒別試驗(yàn)；

　?。?）分子大小分布：應(yīng)采用凝膠過濾或高效液相色譜（HPLC）等適宜方法測(cè)定純化多糖的分子大小分布，并建立相應(yīng)的KD 值合格標(biāo)準(zhǔn)，不同批純化多糖的KD 值應(yīng)保持一致；

　　（3）采用凍干保存的純化多糖，其水分含量應(yīng)合格；

　?。?）多糖含量：應(yīng)采用特定的方法測(cè)定糖含量，如磷含量測(cè)定、唾液酸含量測(cè)定和核糖含量測(cè)定等方法；

　?。?）雜蛋白含量：應(yīng)采用Lowry 法、BCA法等方法測(cè)定純化多糖中蛋白雜質(zhì)的含量，應(yīng)同時(shí)采用相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品作蛋白測(cè)定對(duì)照；

　?。?）核酸雜質(zhì)含量：應(yīng)采用紫外260nm測(cè)定等方法測(cè)定純化多糖中核酸雜質(zhì)含量；

　?。?）應(yīng)采用家兔熱原試驗(yàn)或鱟試驗(yàn)定量測(cè)定方法測(cè)定純化多糖中的熱原質(zhì)及內(nèi)毒素含量；

　　3．修飾處理后的多糖：多糖與載體蛋白結(jié)合前通常需先經(jīng)化學(xué)修飾，即活化（例如可采用溴化氰活化多糖）。應(yīng)采用適宜的方法檢測(cè)化學(xué)修飾的效果， 即活化度測(cè)定；另外，可采用凝膠過濾或高效液相色譜等適宜方法測(cè)定活化后多糖的分子大小分布，以確保多糖－蛋白結(jié)合反應(yīng)的批間一致性。

　?。ǘ┹d體蛋白的質(zhì)量控制

　　載體蛋白生產(chǎn)用菌種和培養(yǎng)基的質(zhì)控原則與多糖抗原生產(chǎn)用菌種和培養(yǎng)基的質(zhì)控原則相同。

　　結(jié)合疫苗常用的載體蛋白包括有：破傷風(fēng)類毒素、白喉毒素?zé)o毒變異蛋白（CRM197）和B群腦膜炎球菌外膜蛋白等。

　　如果采用已有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的破傷風(fēng)類毒素和白喉類毒素等作為載體，其各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》的要求，尤其要注意確保載體蛋白的純度。

　　采用國(guó)外已通過臨床試驗(yàn)驗(yàn)證的安全有效的CRM197 蛋白、B群腦膜炎球菌外膜蛋白等作為載體，應(yīng)參照國(guó)外相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其特性和純度進(jìn)行質(zhì)量復(fù)核：（1）可采用HPLC法等適宜方法測(cè)定CRM197 蛋白的純度，其純度應(yīng)在90% 以上；應(yīng)確保CRM197 蛋白的氨基酸序列正確無誤。如果與白喉類毒素在同一車間生產(chǎn)，應(yīng)建立能區(qū)分CRM197 蛋白和白喉毒素的方法，并應(yīng)符合中國(guó)藥品GMP要求。（2）可采用SDS-PAGE 圖譜分析測(cè)定純化后B群腦膜炎球菌外膜蛋白復(fù)合物的組成；其脂多糖的含量不應(yīng)超過8%；家兔熱原試驗(yàn)應(yīng)合格。

　　采用上述以外的其它蛋白作為載體，應(yīng)參照上述蛋白載體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，結(jié)合其自身特點(diǎn)建立相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)和復(fù)核。

　　可采用血清學(xué)方法進(jìn)行載體蛋白的鑒別試驗(yàn)。用于檢測(cè)載體蛋白理化特性的常用方法包括：SDS-PAGE 圖譜分析、等電聚焦分析、HPLC測(cè)定、氨基酸分析、氨基酸序列分析、旋光度測(cè)定、熒光分光光譜分析、肽圖譜分析和質(zhì)譜分析等。

　　如果載體蛋白與多糖結(jié)合前需進(jìn)行活化處理，應(yīng)建立測(cè)定蛋白活化程度的方法，以確保批與批之間的一致性。

　?。ㄈ┒嗵?蛋白結(jié)合物原液的質(zhì)量控制

　　不同的結(jié)合疫苗可能采用不同的多糖-蛋白結(jié)合工藝，但均需要進(jìn)行多步反應(yīng)。為了確保多糖-蛋白結(jié)合物的穩(wěn)定性、安全性和批間一致性，應(yīng)建立相應(yīng)的質(zhì)量控制方法。由于結(jié)合反應(yīng)可能影響多糖的結(jié)構(gòu)，多糖-蛋白結(jié)合后（單價(jià)結(jié)合物未混合前）應(yīng)進(jìn)行多糖的鑒別試驗(yàn)。此外，還應(yīng)對(duì)純化后的多糖-蛋白結(jié)合物進(jìn)行以下檢測(cè)：

　　1．應(yīng)采用適宜的檢測(cè)方法，確證多糖-蛋白結(jié)合物原液經(jīng)過純化后，多糖-蛋白結(jié)合反應(yīng)中所使用的試劑（如溴化氰、ADH和EDAC等化學(xué)試劑）已被清除；

　　2．如果化學(xué)結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生了獨(dú)特的結(jié)合標(biāo)志（例如某一獨(dú)特的氨基酸），可通過測(cè)定該標(biāo)志物定量分析多糖—蛋白結(jié)合反應(yīng)的程度，也可將結(jié)合物中多糖/蛋白比作為判斷結(jié)合反應(yīng)的一個(gè)間接標(biāo)志；

　　3．殘留的活化功能基團(tuán)：結(jié)合物中多糖或載體蛋白均應(yīng)不再殘留有活化后未結(jié)合的功能基團(tuán)；

　　4．結(jié)合及未被結(jié)合的多糖含量：結(jié)合多糖為結(jié)合疫苗中的免疫保護(hù)抗原。未被結(jié)合的游離多糖不得超過一定比例?？芍苯訙y(cè)定游離多糖的含量，或先將結(jié)合多糖和未結(jié)合多糖分離后測(cè)定結(jié)合多糖的含量。將結(jié)合多糖和游離多糖分離的方法包括沉淀、凝膠過濾、超濾或超離等方法；

　　5．蛋白含量：可采用HPLC等適宜方法測(cè)定多糖-蛋白結(jié)合物中結(jié)合蛋白和未結(jié)合蛋白的含量；

　　6．多糖/蛋白比：分別測(cè)定結(jié)合物中結(jié)合多糖和結(jié)合蛋白的含量；

　　7．分子大小分布：結(jié)合物原液應(yīng)逐批進(jìn)行相對(duì)分子大小的測(cè)定，可采用凝膠過濾或液相色譜等方法進(jìn)行測(cè)定，所建立的方法應(yīng)能將多糖-蛋白結(jié)合物與未結(jié)合的多糖、蛋白區(qū)分開；

　　8．無菌試驗(yàn)應(yīng)合格；

　　9．結(jié)合物中載體蛋白的毒性試驗(yàn)：如果采用破傷風(fēng)類毒素和白喉類毒素作為載體蛋白，應(yīng)按現(xiàn)行版《 中國(guó)藥典》的要求，對(duì)多糖-蛋白結(jié)合物進(jìn)行破傷風(fēng)類毒素和白喉類毒素的毒性試驗(yàn)；

　　10．可對(duì)結(jié)合物進(jìn)行熱原試驗(yàn)及內(nèi)毒素含量測(cè)定。

　　疫苗原液在稀釋、分裝前可加入適宜和適量的佐劑、防腐劑及保護(hù)劑。多價(jià)結(jié)合疫苗既可在各單價(jià)結(jié)合物原液混合后加入佐劑、防腐劑及保護(hù)劑，也可在各單價(jià)結(jié)合物原液中加入佐劑、防腐劑及保護(hù)劑后再混合。稀釋分裝前無菌試驗(yàn)應(yīng)合格。

　?。ㄎ澹┏善返馁|(zhì)量檢定

　　1．鑒別試驗(yàn)：通常采用多糖的特異性抗體進(jìn)行免疫學(xué)測(cè)定；

　　2．無菌試